Microorganismos resistentes al THPS con potencial de actividad corrosiva en la industria petrolera

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Este trabajo fue seleccionado del 4° Congreso de Integridad y Corrosión en la

Industria del Petróleo y del Gas realizado por el IAPG en 2021

 

La corrosión influenciada microbiológicamente (CIM) es un proceso donde los microorganismos pueden iniciar, facilitar o acelerar la corrosión. Distintas sustancias son empleadas en los ambientes industriales para tratar de controlar la presencia de microorganismos involucrados en CIM. La industria petrolera se suele utilizar el sulfato de tetrakis (hidroximetil) fosfonio (THPS).

 

La corrosión es un proceso natural que produce el deterioro de los metales, resultante de su interacción con el medio ambiente. Afecta varios sectores como la producción, el transporte y refinación de hidrocarburos.

 

Los microorganismos cambian las condiciones electroquímicas en la interface metal / solución por adhesión de las células a la superficie del metal, la formación de biofilms con la consecuente liberación de metabolitos, lo que induce o acelera el proceso de corrosión influenciada microbiológicamente (CIM) (Moura et al., 2013).

 

Los microorganismos causales han sido clasificados en grupos microbianos según sus actividades metabólicas, como los procariotas productores de sulfuro que incluyen reductores de sulfato y tiosulfato (Machuca y Polomka, 2018), productores de ácido (Gu, 2014), metanógenos (Uchiyama et al., 2010), oxidantes de hierro (Liu et al., 2014) y bacterias reductoras de hierro (Herrera & Videla, 2009). Dichos microorganismos son parte de la microbiota normal de los yacimientos de petróleo (Ollivier & Magot, 2005), que cuando alcanzan la superficie pueden colonizar la infraestructura metálica de las instalaciones de producción durante el proceso de extracción de petróleo y gas.

 

El monitoreo de la actividad microbiana en las instalaciones de producción es parte de la gestión de la corrosión de los activos de la industria del petróleo y gas. La evaluación microbiológica se realiza rutinariamente para detectar la presencia de microorganismos causantes de la CIM y para evaluar la efectividad de los tratamientos con biocidas utilizados para su mitigación. Las diferentes formulaciones de biocidas son diseñadas con la finalidad de eliminar el desarrollo microbiano. Sin embargo, el aumento de la resistencia al biocida es siempre uno de los principales problemas asociado a su uso. El costo del tratamiento con biocida, junto con el transporte al yacimiento son causas que llevan a evitar la aplicación de altas concentraciones durante largos períodos de tiempo. De este modo, un tratamiento irregular y desordenado termina favoreciendo la aparición de resistencia (Augustinovic et al., 2012). Así mismo, dada la imposibilidad de eliminar todas las bacterias del biofilm, la interrupción del tratamiento permitirá eventualmente que las células restablezcan sus actividades.

 

En este contexto, el objetivo del trabajo fue evaluar la eficacia de una aplicación del biocida sulfato de tetrakis (hidroximetil) fosfonio (THPS) sobre las poblaciones bacterianas presentes en agua de tanque de almacenamiento de crudo.

 

Materiales y Métodos

 

Se dispusieron de 50 frascos conteniendo 10 ml de agua de tanque esterilizada por filtración, con dos cupones de acero al carbono tipo SAE 1010 (10x20x1mm) por frasco. Los frascos fueron inoculados con una suspensión bacteriana obtenida por enriquecimiento a partir de una muestra de agua de tanque. Un set de 25 frascos fue tratado con 250 mg.l-1 de THPS (tratamiento ATK+THPS) dejando el resto como control biótico (tratamiento ATK). Finalmente, se agregó crudo en todos los frascos y se incubaron en condiciones anóxicas.

 

Asimismo, realizaron controles abióticos. Se prepararon 30 frascos de la misma manera que para el estudio del efecto del biocida, pero en este caso, los frascos no fueron inoculados. A la mitad de ellos se les agregó el biocida. Estos frascos fueron denominados CAB+THPS y CAB.

Se determinó la concentración de THPS mediante iodometría.  Los aniones fueron cuantificados por cromatografía iónica usando un detector de conductividad (Chen et al., 2017). La determinicación de carbono orgánico total se realizó en un analizador de carbono de alta temperatura (Martin at al., 2014).

 

Se realizaron extracciones de ADN de las muestras planctónicas y sésiles con el kit E.Z.N.A Soil DNA (Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA) a los 3, 8, 15 y 60 días.

 

Periódicamente fue monitoreada la concentración de poblaciones de bacterias y arqueas de muestras de agua y del biofilm desarrollado sobre los cupones metálicos, mediante PCR cuantitativa en tiempo real (q-PCR). Se usaron los primers 1055F/1392R para la cuantificación del gen 16S rRNA de bacterias y el 344F/519R para el 16S rRNA de arqueas. La cuantificación se llevó a cabo mediante curvas de calibración estándar realizadas a partir de diluciones del plásmido que contenía como inserto el gen de interés. Los resultados se expresaron como Nº de copias/ml para muestra líquida o Nº de copias/cm2 para muestra de cupón para cada gen.

 

Para estudiar la diversidad del gen 16S rRNA de bacterias y arqueas se realizó secuenciación de última generación de las muestras de agua de tanque de almacenamiento sin inóculo (TK), del tratamiento ATK a los 3, 8 y 60 días y del tratamiento ATK+THPS a los 8 y 60 días. La amplificación se llevó a cabo con los primers 341F/806R para bacterias y 349F/806R para arqueas usando la plataforma Miseq Illumina. Se utilizó Qiime2 para el análisis bioinformático y el software R para el análisis estadístico y realización de gráficos.

 

Los datos obtenidos en las medidas de concentración de THPS y de bacterias y arqueas se expresaron como promedios de triplicados con la respectiva desviación estándar. En esta última, la diferencia significativa entre dichos promedios se evaluó por comparación a través del test de varianza ANOVA.

 

Cupones metálicos fueron retirados de los frascos a las 24 h, 30 y 60 días para realizar medidas electroquímicas. Para la determinación de la resistencia de polarización mediante la técnica de Resistencia de Polarización Lineal (LPR) se realizaron curvas de polarización haciendo un barrido de ± 25 mV alrededor del potencial a circuito abierto (PCA) a una velocidad de barrido de 0,166mV.s-1. Barridos potenciodinámicos fueron realizados a la misma velocidad en un rango de  ± 500 mV vs. PCA. Los espectros de impedancia electroquímica (EIS) fueron obtenidos aplicando una onda sinusoidal de 10 mV (vs. PCA) entre 0,01 Hz and 20000 Hz. Todas las medidas electroquímicas se realizaron a temperatura ambiente en una celda de tres electrodos con el cupón de acero SAE 1010 como electrodo de trabajo, un electrodo de calomel saturado como referencia y un alambre de platino como contraelectrodo. El electrolito usado fue agua de tanque filtrada.

 

Para la microscopía electrónica de barrido (MEB), los cupones fueron retirados al día 60 y se procedió a la fijación del biofilm sumergiendo el cupón en una solución de glutaraldehído (Sigma-Aldrich) al 2,5% en buffer fosfato salino (PBS) durante 24 horas. Posteriormente, se realizaron pasos sucesivos de deshidratación con etanol desde el 20% hasta el 100% dejándose 30 minutos en cada solución, secado por punto crítico y metalizado con oro. Las observaciones de MEB se realizaron en un equipo FEI Quanta 200 (ThermoFisher, USA).

 

 

Resultados y Discusión

 

En la Tabla 1 se presenta la composición del agua de tanque  de almacenamiento (TK) utilizada en el experimento. El agua se caracterizó por una baja salinidad y concentración de sulfato. La estabilidad del biocida fue analizada en el agua de almacenamiento, en presencia (ATK+THPS) y ausencia de microorganismos (CAB+THPS), Figura 1. Bajo ambas condiciones el principio activo disminuyó su concentración hasta un valor no detectable luego de 8 días. Este comportamiento fue atribuido a la composición del agua de almacenamiento, dado que en agua destilada la concentración del THPS se mantuvo estable en el valor de inicio, durante los 60 días del experimento.

 

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Tabla 1.Composición Química del agua de tanque de almacenamiento.

 

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Figura 1.Cinética del biocida THPSdurante el tratamiento en batch inoculado (ATK+THPS) y control abiotico (CAB+THPS).

 

 

Efecto del THPS sobre la densidad de las poblaciones microbianas

 

La Figura 2 muestra la variación del número de copias del gen 16S rARN/ml de bacterias y arqueas en los tratamientos ATK y ATK+THPS. En ella se aprecia que la población de bacterias planctónicas se mantiene estable durante los primeros 10 días del tratamiento ATK, finalizando en aproximadamente 107 copias/ml a los 60 días. La presencia del THPS produjo un significativo efecto (aunque de corta duración) reduciendo un 62% la concentración de la población bacteriana en los primeros días de tratamiento. A los 60 días ya no se registró diferencia entre tratamientos. El descenso apreciado a los 15 días en ambos tratamientos fue atribuido a la adaptación del inóculo a las condiciones del ensayo. En cuanto a la capacidad de adhesión de las células de bacterias al cupón metálico, no fue detectado algún efecto del biocida en comparación con lo observado en el tratamiento control.

 

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Figura 2. Dinámica del número de copias del gen 16S rRNA de bacterias planctónicas y en biofilm (A) y arqueas planctónicas y en biofim (B) durante los tratamientos ATK y ATK+THPS. La flecha indica el momento de aplicación del biocida. Distintas letras indican diferencias significativas para la misma población durante los días de tratamiento.

 

Similarmente a lo observado en bacterias, el biocida produjo una significativa reducción de la población de arqueas en los primeros días (50%), no registrándose diferencias con el control hacia el final del experimento. Respecto de la población adherida al cupón, se observó un aumento significativo de células adheridas al día 15 en presencia del biocida. Este comportamiento no se observó al finalizar el tratamiento. Independientemente del estado de la célula (planctónica o sésil) y de la presencia del biocida, las concentraciones celulares al final del experimento fueron similares, ~104.

 

Efecto del THPS sobre la diversidad de las comunidades microbianas

 

El resultado del análisis taxonómico de la comunidad de bacterias y arqueas durante los tratamientos con y sin biocida se muestran en la Tabla 2. Para su interpretación se utilizaron los índices de alfa diversidad Chao (riqueza), Shannon (diversidad) e inversa del índice de Simpson (uniformidad). Las curvas de rarefacción (dato no mostrado) y el porcentaje de cobertura (>99%) indicaron que los resultados obtenidos fueron suficientes para cubrir la mayor parte de la diversidad.

 

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Tabla 2. Análisis de diversidad de las comunidades microbianas en agua de tanque luego de 3, 8 y 60 días de tratamiento sin y con THPS (250mg.l-1).

 

El análisis de diversidad evidenció que el inóculo agregado al agua de tanque modificó ambas comunidades nativas, reduciendo inicialmente la riqueza y diversidad de la comunidad de bacterias, conservando un arreglo equitativo. Respecto de la comunidad de arqueas, la riqueza no se vio afectada inicialmente como seria esperado, siendo que el inóculo no contenía células de arqueas. Su efecto se evidenció en el aumento de la diversidad y uniformidad de especies. La disminución de la riqueza observada a los 8 días pudo ser consecuencia de la adaptación de la comunidad a las condiciones de incubación.

 

A los 8 días de iniciado el tratamiento con THPS no se observaron marcados cambios en la riqueza y diversidad de la comunidad de bacteria. Si bien luego de 60 días se registró un incremento en la riqueza, éste fue muy bajo comparado con el aumento de dos veces observado en ausencia del biocida. La comunidad finalmente establecida luego del tratamiento con biocida resultó menos diversa y uniforme, comparado con la comunidad del tratamiento control (sin biocida).

El agregado de THPS no afectó inicialmente la riqueza ni diversidad de la comunidad de arqueas, similarmente a lo observado en bacteria, rindiendo un arreglo más equitativo. La comunidad establecida luego de 60 días resultó más rica en especies, diversidad y comparativamente algo más uniforme respecto del tratamiento control, contrariamente a lo observado en la comunidad de bacteria.

 

La Figura 3A muestra la composición taxonómica a nivel de orden (>2%) de la comunidad nativa de la muestra de agua de tanque (TK) utilizada en el experimento. Los órdenes presentes en menos del 2 % se agruparon en “Otros” y los no clasificados como “Unassigned”. En ella se aprecia que la comunidad de bacterias estuvo representada por miembros de los orden Clostridiales (23%), un grupo no cultivable perteneciente a la clase JS1 del filo Atribacteria (20%), Bacteroidales (14%) y Anaerolineales (10%).

 

Los órdenes determinados en el agua de tanque son frecuentemente encontrados en aguas de sistemas petroleros (Alireza Bahadori, 2018), e incluyen microorganismos degradadores de hidrocarburos (Anaerolineales) y quimioheterótrofos fermentadores secundarios (Bacteroidales), capaces de utilizar intermediarios de la degradación de hidrocarburos para generar precursores metanogénicos (Kunapuli et al., 2007).

 

Miembros de Atribacteria también han sido detectados en agua de producción y en cultivos de enriquecimiento de degradación de hidrocarburos. Aunque aún no es claro el rol fisiológico y ecológico, un reciente estudio infirió por herramientas genómicas que este filo tendría el potencial de asimilar varios sustratos heterotróficos permitiéndole competir con otros fermentadores primarios y secundarios, como así también mediante interacciones sintróficas con metanógenos asociados (Lee et al., 2018).

 

La Figura 3B muestra la composición taxonómica a nivel de orden de la comunidad de arqueas en el agua de tanque, representada principalmente por miembros del orden Methanosarcinales (93%). Su marcada abundancia esta en relación con la capacidad de miembros de este orden de metabolizar productos de degradación de los fermentadores primarios, como el acetato llevándolo a metano y dióxido de carbono a través de la vía acetoclástica (Kendall & Boone, 2006; Morris et al., 2013)

 

El agregado de inóculo modificó parcialmente la composición de bacterias, conservando la presencia de miembros de Bacteroidales (19%) y Clostridiales (15%) luego de 3 días de tratamiento ATK. En el heatmap de la Figura 6A se aprecia dicha semejanza, en la asociación temprana de los perfiles de las muestras a los 3 y 8 días de tratamiento en ausencia del biocida, atribuido principalmente a miembros del orden Lactobacillales (18%-17%), Bacteroidales (19%-15%) y Clostridiales (15%-12%).

 

El agregado de inóculo redujo la dominancia de Methanosarcinales del 93% al 62%, a expensas del aumento de Mehanomicrobiales (21%) hasta los 8 días de tratamiento. Miembros de este orden son reconocidos hidrogenotrofos (Browne et al., 2017; Garcia et al., 2006).

 

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Figura 3. Composición taxonómica de la comunidad de bacterias (A) y arqueas (B) en el agua de tanque (TK) y luego de 3 días de realizada la inoculación (SIN_3). El análisis se realizó a nivel de Orden. Los órdenes representados por < 2% se agruparon en “Otros”.

 

El efecto inicial del biocida se observó en la reducción de miembros del orden Lactobacillales (10%) y Betaproteobacteriales (5%), y en la selección de miembros del orden Bacteroidales (32%), conservando la abundancia de Clostridiales (16%) como se muestra en la figura 4. Sin embargo, la asociación de los perfiles sin biocida sugiere que éste no produjo un marcado efecto inicial en la abundancia de filos de comunidad de bacteria.

 

Respecto de la comunidad de arqueas, figura 5, el biocida redujo aún más la dominancia de Methanosarcinales llevando la relación a 36:48 y favoreciendo la selección de Methanomassiliicoccales (14%). Miembros de este último orden, metilótrofos, pueden desarrollarse a expensas de metanol y H2 (Vanwonterghem et al., 2016). Considerando el aporte de metanol producido durante la degradación anaeróbica del THPS (Salgar-Chaparro & Machuca, 2019), es posible atribuir el aumento al 14% de este orden al efecto del biocida.

 

El tratamiento con el biocida seleccionó luego de 60 días una comunidad representada principalmente por miembros de los órdenes Campylobacterales (21%), Pseudomonadales (20%), Betaproteobacteriales (17%) y Clostridiales (17%).

 

La presencia de miembros de la familia Arcobacteraceae (Campylobacterales) con actividad oxidante de sulfuros, podría aportar sulfatos como aceptor final de electrones para otros miembros heterótrofos reductores de sulfatos de la comunidad.

 

La presencia de miembros del genero Acinetobacter (orden Pseudomonadales), puede ser explicada a través de su descripción como putativo sulfato reductor (Irianni-Renno et al., 2016).

 

Bajo condición anóxica estas células tendrían la capacidad de sintetizar polihidroxialcanoatos a expensas de los ácidos volátiles, como material de reserva (Kim et al., 1997). Esta propiedad también ha sido descripta en miembros del género Aquabacterium (Betaproteobacteriales) (Kalmbach et al., 1999) desarrollándose a expensas de ácidos orgánicos, aunque en microaerofilia.

 

Junto con filotipos de Clostridiales y mediante un metabolismo fermentativo estas poblaciones aportarían ácidos orgánicos volátiles, modelando en su conjunto, un ambiente propicio para los microorganismos reductores de sulfato.

 

Notoriamente, la comunidad finalmente seleccionada no incluyó miembros del orden  Anaerolineales, quienes fueron dominantes en el tratamiento sin biocida con un 27% de abundancia.

 

La comunidad de arqueas recuperó la relación Methanosarcinales:Mehanomicrobiales a 55:33 a expensas de la reducción de Methanomassiliicoccales (10%), en correlación con la degradación del THPS. El heatmap (Figura 6B), evidenció el marcado efecto inicial del biocida asociando el perfil de la comunidad a los 8 días en último lugar, luego del perfil a los 60 días. Dicha similitud podría sugerir que el efecto inicial del biocida se extendió a través de los 60 días de tratamiento.

 

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Figura 4. Perfiles taxonómicos de las comunidades bacterianas a los 8 y 60 días de iniciado el tratamiento con THPS y sin el biocida. El análisis se realizó a nivel de Orden (>2%). Los órdenes representados < 2 % se agruparon en “Otros”. Los tratamientos ATK+THPS se indican con la palabra “CON” y los tratamientos ATK con la palabra “SIN”. El número indicado en cada rótulo de los tratamientos señala el día de incubación.

 

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Figura 5. Perfiles taxonómicos de las comunidades de arqueas a los 8 y 60 días de iniciado el tratamiento con THPS y sin el biocida. El análisis se realizó a nivel de Orden (>2%). Los órdenes representados < 2 % se agruparon en “Otros”. Los tratamientos ATK+THPS se indican con la palabra “CON” y los tratamientos ATK con la palabra “SIN”. El número indicado en cada rótulo de los tratamientos señala el día de incubación

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Figura 6. Heatmap de la comunidad de bacterias (A) y arqueas (B). El gráfico describe la frecuencia de cada género (variables agrupadas en el eje Y) en cada una de las muestras (agrupamiento en el eje X). Los valores en el heatmap corresponden a las abundancias relativas de los géneros mayores al 2%, y se encuentran representados por la intensidad del color según la leyenda que se muestra en la figura. Los tratamientos ATK+THPS se indican con la palabra “CON” y los tratamientos ATK con la palabra “SIN”. El número indicado en cada rótulo de los tratamientos señala el día de incubación.

 

Comportamiento electroquímico del acero al carbono SAE 1010

 

Para caracterizar el proceso corrosivo que sufre el acero SAE 1010 en los sistemas bajo estudio se calculó la velocidad de corrosión instantánea a partir de los valores de Resistencia de polarización (Rp) obtenidos por LPR y EIS. Hay discrepancias menores en los valores calculados por ambas técnicas, pero tanto la magnitud de las propiedades como sus tendencias son similares. La Tabla 3 muestra los valores de Rp obtenidos y los valores de velocidad de corrosión (en mpy) calculados a partir de Rp.

 

La velocidad de corrosión  calculada fue en todos los casos muy superior al límite recomendado por NACE como valor aceptable (menor a 1mpy para corrosión generalizada y menor a 5 mpy para corrosión localizada) (NACE, 2013). La presencia del biocida tuvo una mayor influencia en la corrosión al inicio del experimento, cuando la superficie del acero estaba aún limpia. Luego de un día de aplicación del THPS se aprecia un descenso de la velocidad de corrosión medida por LRP, respecto de la velocidad medida en los sistemas sin THPS, independientemente de la presencia de microorganismos. Este comportamiento podría estar relacionado con la adsorción del biocida sobre la superficie, bloqueándola parcialmente. Esta idea se refuerza por el hecho de que la densidad del biofilm determinada sobre cupones fue similar en presencia o ausencia del THPS

La corta vida del THPS en el agua de tanque hace que su efecto inicial no se pueda mantener en el tiempo. Luego de 2 meses de exposición de los cupones a los distintos tratamientos, cuando la superficie de los cupones de acero ya se encontraba cubierta con depósitos de productos de corrosión, compuestos inorgánicos  y/o biofilms, la velocidad de corrosión fue similar en todos ellos. El nivel de cloruro en el agua de tanque resultó suficiente para promover la corrosión del acero al carbono por picado (Cáceres et al., 2009). Los valores de los potenciales de picado obtenidos a partir de las curvas potenciodinámicas (Tabla 3) estuvieron en el rango de -0,612 hasta -0,650 V muy próximos a los PCA lo que es indicativo de una alta susceptibilidad a sufrir corrosión localizada por parte del acero al carbono SAE 1010 durante los tratamientos. Los valores de velocidades de corrosión presentados en la Tabla 3 fueron 3 órdenes de magnitud superiores a los reportados por Rajala et al. (2019) para la corrosión de acero al carbono en presencia de bacterias sulfato reductoras y arqueas metanogénicas en un sistema donde la concentración de cloruros era muy baja (525 mg.l-1).

 

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Tabla 3. Parámetros obtenidos a partir de las técnicas electroquímicas: Resistencia de polarización lineal y Curvas de polarización potenciodinámicas luego de 1 y 60 días de tratamiento sin y con THPS.

 

Las altas velocidades de corrosión medidas se correspondieron con las observaciones de la superficie de los cupones expuestas por 60 días al agua de tanque con y sin THPS realizadas a través del microscopio electrónico de barrido (Figura 7 A-D). En las microfotografías se aprecia una  gran cantidad de productos de corrosión  formado sobre los cupones de acero al carbono SAE 1010. En el caso de los cupones expuestos al agua de tanque inoculada, es posible distinguir microorganismos entre los depósitos inorgánicos.

 

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Figura 7. Microfotografías tomadas con el microscopio electrónico de barrido de los cupones de acero SAE 1010 luego de 60 días de tratamiento. A) ATK; B) ATK+THPS; C) CAB; D) CAB+THPS

 

Conclusiones

 

El tratamiento con THPS (250 mg.l-1) resultó efectivo reduciendo inicialmente la concentración de poblaciones microbianas, tanto bacterias (63%) como arqueas (50%) en agua de tanque de baja salinidad.

 

El efecto inicial del THPS también se apreció en la reducción de la velocidad de corrosión, aun en presencia de biofilm, sugiriendo una acción inhibitoria de la corrosión microbiana.

No obstante la significativa reducción de la densidad de poblaciones planctónicas, su aplicación no tuvo un mayor impacto sobre la diversidad de bacterias, favoreciendo así mismo la selección de órdenes de arqueas involucrados en procesos de corrosión.

 

Debido a la corta duración del principio activo en agua de tanque, luego de 60 días la diversidad de bacterias y arqueas sugirió un ambiente propicio para el desarrollo de microorganismos reductores de sulfato.

 

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